大分子樣品制備是實(shí)驗(yàn)室日常工作中常見的任務(wù)之一。例如DNA、RNA和蛋白質(zhì)的脫鹽、再緩沖、復(fù)性、沉淀、解析。幸運(yùn)的是，樣品制備有現(xiàn)成的方法。一個(gè)例子是在FLPC分離后去除純化蛋白質(zhì)中的鹽。另一個(gè)例子是DNA測(cè)序反應(yīng)的純化，其中必須去除標(biāo)記的dNTP或引物。例如，如果蛋白質(zhì)被尿素變性以提高其溶解度，則必須進(jìn)一步去除尿素。用戶面臨的問題是，在任何情況下，哪種方法和工具適合他們的特定過程。凝膠過濾法、超濾法和透析法是實(shí)驗(yàn)室的選擇方法。
實(shí)驗(yàn)室中有三種分離方法：
● 凝膠過濾
● 超濾
● 透析
凝膠過濾是一種等度洗脫的非吸收色譜法。樣品按分子大小分開。溶解后的樣品由流動(dòng)相（緩沖液）輸送通過固定相（基質(zhì)）。
較小的分子進(jìn)入基質(zhì)，而較大的分子不能進(jìn)入基質(zhì)。結(jié)果是較大的分子更快地通過基質(zhì)并更早地洗脫。凝膠過濾材料填充在不同長度和直徑的柱中。通常的凝膠過濾材料是葡聚糖（Sephadex), 瓊脂糖（Sepharose, Bio-GelA）或聚丙烯酰胺（Bio-Gel P、BioRad）。目前市場(chǎng)上有各種各樣的凝膠過濾柱。
凝膠過濾是一種廣泛使用的方法，特別是用于脫鹽或分離未純化的蛋白質(zhì)溶液。用戶可以通過凝膠過濾獲得高的樣品回收率，其典型特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單。但也有一些缺點(diǎn)需要在應(yīng)用之前進(jìn)行處理。樣品體積定義了柱的大?。ㄩL度），因?yàn)椴煌肿哟笮『头直媛手g的間隔隨著柱的長度而增加。另一個(gè)缺點(diǎn)是在凝膠過濾后的某些情況下，樣品將被稀釋并必須濃縮。在高通量篩選應(yīng)用和液體處理裝置的使用中也存在限制。
超濾的常見應(yīng)用有
脫鹽、緩沖液交換和濃縮
樣品發(fā)生分子分離
通過半透膜
尺寸較小的分子通過膜
由于離心機(jī)中的向心加速度，該過程通過使用壓力來加速。由于樣品的溶劑通過膜，保留的樣品（在膜上）的體積減小，因此樣品的濃度增加。這是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：
樣品濃度可以簡(jiǎn)單快速地增加。顯著的缺點(diǎn)是樣品可能沉淀、膜污染或堵塞，這通常與樣品損失有關(guān)。市場(chǎng)上有大量不同尺寸、不同膜類型和截止閥的超濾濾筒可供選擇。聚醚砜、尼龍、親水聚丙烯和醋酸纖維素是常見的膜材料。3、10、30、100和300kDa之間的截留量確保了廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。不需要特殊技能或設(shè)備，只需要一臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)
第三種分離方法是通過半透膜的擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)傳輸。
透析介紹
透析是指通過布朗運(yùn)動(dòng)，分子或顆粒通過半透膜從高濃度到低濃度的基于擴(kuò)散的尺寸選擇性運(yùn)輸。透析的選擇性由半透膜的孔徑?jīng)Q定。透析的終點(diǎn)是濃度平衡。透析是一種常用的方法，可以將蛋白質(zhì)或DNA等大分子與鹽或洗滌劑等伴隨物質(zhì)分離。對(duì)于敏感物質(zhì)，這是一種非常溫和的方法。
示例：將蛋白質(zhì)溶解在高濃度的鹽溶液中，例如NaCl溶液。
NaCl干擾了離子交換色譜等后續(xù)步驟。將樣品體積移到具有半透膜的透析裝置中。樣品體積通過半透膜與較高體積的透析緩沖液接觸。只有NaCl離子才能通過膜孔。
蛋白質(zhì)分子不能通過孔隙而被保留。在透析過程中，樣品中的NaCl濃度將明顯降低?？梢酝ㄟ^多次交換透析緩沖液體積將鹽濃度調(diào)節(jié)到任何期望的水平。
透析持續(xù)時(shí)間幾個(gè)方面影響透析持續(xù)時(shí)間：物質(zhì)、濃度、膜或擴(kuò)散路徑的長度以及溫度。
一些制造商如Scienova,技術(shù)數(shù)據(jù)表中描述了常用物質(zhì)的協(xié)議。這些可以用作優(yōu)化類似物質(zhì)的透析條件的基礎(chǔ)。當(dāng)在特殊條件下或使用不太常見的物質(zhì)操作時(shí)，通常需要進(jìn)行初步測(cè)試，以找出獲得所需結(jié)果所需的最佳參數(shù)，特別是所需的透析時(shí)間。
樣品與透析緩沖液之間的濃度差：擴(kuò)散速度取決于透析樣品內(nèi)部與相應(yīng)的透析緩沖液之間的濃度差。透析膜通過化合物的濃度達(dá)到平衡，透析速度下降。在平衡時(shí)，所產(chǎn)生的通量為零。
透析規(guī)則：擴(kuò)散速度取決于分子的大?。ㄔ谌芤核畡?dòng)力直徑中）。一個(gè)較小的分子擴(kuò)散得更快。因此，大多數(shù)鹽所需的透析時(shí)間比典型分子量為200-500 Da的染料要短。
透析的時(shí)間消耗隨到透析膜的擴(kuò)散途徑的長度呈指數(shù)增長。因此，選擇一個(gè)擴(kuò)散長度較短的透析裝置是非常重要的。如果可能，建議攪拌或搖晃透析緩沖液和樣品。它將增加物質(zhì)通過擴(kuò)散的運(yùn)輸。
溫度較高時(shí)，布朗運(yùn)動(dòng)作為擴(kuò)散力的強(qiáng)度較高。因此，在較高的溫度下，透析效率更高。透析規(guī)則溫度：溫度高=透析快。限制是你物質(zhì)的溫度穩(wěn)定性。
膜選擇通過膜的流動(dòng)取決于活性膜面積、活性膜面積與樣品體積之比、孔徑和孔隙率。更大的面積與樣品體積比，更高的孔隙率和更寬的孔隙提高了透析速度。孔隙大小的單位通常是道爾頓（Da）。選擇的膜孔徑應(yīng)盡可能寬，同時(shí)仍然保留所需的樣品物質(zhì)。Da中的孔徑或截止（MWCO）應(yīng)是所需樣品物質(zhì)Da分子量的兩倍。該膜的特性在制造商的技術(shù)資料中都有說明。截止意味著至少保留90 %具有相同分子量的球狀物質(zhì)。
透析緩沖液與透析樣品接觸：在簡(jiǎn)單的情況下，透析緩沖液可以是水。透析緩沖液中的小化合物可以通過半透膜。所選的透析緩沖液必須與樣品制備的所需步驟相兼容。它可用于穩(wěn)定pH或氧化還原電位，以保護(hù)敏感物質(zhì)。如果樣品具有高濃度的低分子量物質(zhì)，那么濃度梯度將引起滲透壓，導(dǎo)致大量的水運(yùn)輸?shù)綐悠分?。在這種情況下，建議首先使用含有相同物質(zhì)的較低濃度物質(zhì)的透析緩沖液的步驟，以降低濃度梯度和滲透壓。蛋白質(zhì)樣品中經(jīng)常使用的緩沖液是磷酸鹽緩沖液、TRIS、MOPS和HEPES。用于蛋白質(zhì)透析的其他物質(zhì)是氨基酸、EDTA、抑制劑、激活劑、輔助因子或DTT。緩沖體積：透析結(jié)果的關(guān)鍵是緩沖體積與樣品體積的比率。透析就像是可透析的化合物在緩沖液體積加上樣品體積中的稀釋。
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